標(biāo)簽： 免疫 血清 制備 實(shí)驗(yàn)

　　本生帶您了解實(shí)驗(yàn)室免疫血清的制備實(shí)驗(yàn)!

　　免疫血清的制備是一項(xiàng)常用的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。價(jià)、高特異性的免疫血清可作為免疫學(xué)診斷的試劑 (如用于制備免疫標(biāo)記抗體等)，也可供特異性免疫治療用。免疫血清的效價(jià)高低取決于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫反應(yīng)性及抗原的免疫原性。如以免疫原性強(qiáng)的抗原刺激高應(yīng)答性的機(jī)體，?？色@得價(jià)的免疫血清。本生生物整理如下：

　　實(shí)驗(yàn)材料：家兔

　　試劑、試劑盒：滅菌生理鹽水 IgG 酒精 dian酒 羊毛脂 石蠟油 BCG FIA FCA-IgG

　　儀器、耗材：剪刀 鑷子 注射器 針頭 稱量瓶 量筒 動(dòng)物固定架 三角燒瓶 手術(shù)器械 血管夾 黑絲線 放血管

　　實(shí)驗(yàn)步驟：

　　1. 心臟采用血法

　　(1) 家兔仰面，四肢縛于動(dòng)物固定架上 (或由助手抓住四肢固定)。

　　(2) 剪去左胸部兔毛，消毒皮膚。

　　(3) 用左姆指摸到胸骨劍突處，食指及中指放在右胸處輕輕向左推心臟，并使心臟固定于左胸側(cè)位置。然后，以左拇指觸摸心臟搏動(dòng)的部位。

　　(4) 用 50 ml 注射器 (連接 16 號針頭)，傾針 45°角度，對準(zhǔn)心搏處刺入心臟抽血致死。

　　(5) 將抽取的血液立即注入無菌三角燒瓶中，待凝固后分離血清。

　　2. 頸動(dòng)脈放血法

　　(1) 家兔仰臥同上固定。頭部略放低以暴露頸部。剃毛及消毒皮膚。

　　(2) 沿頸部中線切開皮膚約 10 cm，分離皮下組織，直至暴露出氣管兩側(cè)的胸鎖乳突肌。

　　(3) 分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，暴露出頸總動(dòng)脈后使之游離。

　　(4) 于動(dòng)脈下套入兩根黑絲線，分別置于遠(yuǎn)心及近心端。結(jié)扎遠(yuǎn)心端的絲線。近心端的動(dòng)脈用血管夾夾住。

　　(5) 用尖頭小剪刀在兩根絲線間的動(dòng)脈璧上剪一小口，插入塑料放血管。再將近心端的絲線結(jié)扎固定于放血管上，以防放血管滑脫。

　　(6) 松開血管夾，使血液流入滅菌三角燒瓶中。一般一只家兔可放血 80～100 ml。

　　三、分離血清

　　將三角燒瓶的血置 37 ℃ 溫箱 1 小時(shí)，再置 4 ℃ 冰箱內(nèi) 3～4 小時(shí)。待血液凝固收縮后，用毛細(xì)滴管吸取血清。于 3000 rpm 離心 15 分鐘，取上清加入防腐劑 (0.01 % 硫柳汞或 0.02 % 疊氮鈉，最終濃度)，分裝后置 4 ℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

　　注意事項(xiàng)：

　　1. 免疫用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的抗體反應(yīng)性個(gè)體差異性較大，因此免疫時(shí)至少應(yīng)選用兩只以上動(dòng)物。另外，不能使用妊娠動(dòng)物。

　　2. 免疫用的抗原必須經(jīng) FCA 或 FIA 充分乳化后才能注射，否則將明顯影響抗原的免疫效果。上述制備乳化抗原的方法較費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。采用 H-81 微型振蕩混合器法或三腔管研磨法制備。前者是將抗原液與佐劑按比例混合后，置于混合器上使之劇烈振蕩 (頻率 2900 轉(zhuǎn)/分，振幅 6 mm); 后者是將免疫用的佐劑和抗原液按比例混合后，吸入注射器內(nèi)再將注射器連接于三腔管上反復(fù)抽吸研磨。這兩種方法約 1 小時(shí)即可使抗原充分乳化。

　　3. 佐劑一方面可提高特異性免疫反應(yīng)的效果獲得高效價(jià)的免疫血清，但若抗原不純時(shí)，可使抗原中極微量的污染物 (0.005 mgN) 產(chǎn)生抗體，以致導(dǎo)致免疫血清的純度受到影響。另外，有些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種系對 BCG 過敏，尤其是豚鼠其次是家兔，當(dāng)再次注射*佐劑時(shí)，可以引起變tai反應(yīng)而導(dǎo)致免疫失敗。為此，第二次免疫注射時(shí)應(yīng)減少佐劑中 BCG 的含量或改用不*佐劑，以減少和防止變tai反應(yīng)的發(fā)生。

　　4. 抗原的劑量決定于抗原的種類。對免疫原性強(qiáng)的抗原劑量應(yīng)相別較少，免疫原性弱的抗原劑量可相對較多?？乖挠昧恳话阋泽w重計(jì)算。在使用佐劑的情況下，一次注入的總劑量以 0.5 mg/kg 體重為宜。如不加佐劑時(shí)劑量可加大 10 倍。另外，免疫周期長者可少量多次注射，免疫周期短者可較大量少次注射。

　　5. 免疫方法上也可采用多點(diǎn)注射法免疫動(dòng)物。即于家兔脊柱兩旁選 4-6 點(diǎn)皮下注射，同時(shí)于兩側(cè)肩部 (或臂部) 和鼠蹊部各注一處。每點(diǎn)注 0.2 ml，間隔 2 周后再于上述部位選不同點(diǎn)同上注射，也可產(chǎn)生高效價(jià)的免疫血清。

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